核磁共振波谱法等实验方法介绍

(一)原子核的自旋与原子核的磁矩

核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance NMR)波谱学是近几十年发展的一门新学科。1945年以F.Block和E.M.Purcell为首的两个研究小组分别观测到水、石蜡中质子的核磁共振信号,为此他们荣获1952年Nobe1物理奖。今天,核磁共振已成为化学、物理、生物、医药等研究领域中必不可少的实验工具,是研究分子结构、构型构象、分子动态等的重要方法。

核磁共振研究的对象是具有磁矩的原子核。原子核是由质子和中子组成的带正电荷的粒子,其自旋运动将产生磁矩。但并非所有同位素的原子核都具有自旋运动,只有存在自旋运动的原子核才具有磁矩。原子核的自旋运动与自旋量子数I相关。量子力学和实验均已证明,I与原子核的质量数(A)、核电荷数(Z)有关。I为零、半整数、整数。

A为偶数、Z为偶数时,I=0。如12C6,.^{16}O_8,^{32}S_{16}等。

A为奇数、Z为奇数或偶数时,I为半整数。如.^1H_1,^{13}C_6,^{15}N_7,^{19}F_9,^{31}P_{15}等I = 1/2;.^{11}B5,^{33}S_{16},^{35}Cl_{17},^{37}Cl_{17},^{81}Br_{35}

I = 3/2;.^{17}O_8,^{25}Mg_{12},^{27}Al_{13}等I = 5/2。

A为偶数、Z为奇数时,I为整数。如.^2H_1,^6Li_3,^{14}N_7等 I = 1;.^{58}Co_{27}等I = 2;

.^{10}B_5等I= 3。

I≠0的原子核,都具有自旋现象,其自旋角动量(P)为 P = h/2I( I + 1),h为普朗克常数 6.624 * 10-34 J.S

具有自旋角动量的原子核也具有磁矩,μ与P的关系如下:μ = γ P

μ 称磁旋比(magnetogyric ratio)。同一种核,μ 为常数。如

  • .^1H_1:μ = 2.6752*108rad T-1S-1);
  • .^13C: = 6.728(107rad T-1S-1);

T =104Gs(高斯)。值可正可负,是核的本性所决定。

I = 1/2的原子核是电荷在核表面均匀分布的旋转球体。核磁共振谱线较窄,最适宜于核磁共振检测,是NMR研究的主要对象。如.^1H,^13C,^19F,^31P 等。

I > 1/2的原子核是电荷在核表面非均匀分布的旋转椭球体。

(二) 核磁共振

根据量子力学理论,磁性核(I ≠0)在外加磁场(B0)中的取向不是任意的,而是量子化的,共有(2I + 1)种取向。可由磁量子数m表示。m=I,I - 1,…(-I + 1)、-I。

1H:I = 1/2, m=+1/2,-1/2

14N:I = 1, m=+1,0,-1 核的自旋角动量(P)在Z轴上投影Pz也只能取不连续的数值。

Pz = h/2•m 与Pz相应的核磁矩在Z轴上的投影μz, μz = γPz = γ•h/2•m

磁矩与磁场相互作用能为E, E = - μz¬B0

E(+1/2) = - μz¬B0 = - μ•(+1/2)h/2•B0

E(-1/2) = - μz¬B0 = - μ•(-1/2)h/2•B0

由量子力学的选律可知, 只有Δm = ±1的跃迁才是允许的跃迁。所以相邻两能级间的能量差为:

E = E(-1/2) - E(+1/2) = μ•h/2•B0

上式表明,ΔE 与外加磁场B0的强度有关, ΔE随B0场强的增大而增大。

在Bo中,自旋核绕其自旋轴(与磁矩μ方向一致)旋转,而自旋轴既与Bo场保持一夹角又绕B0场进动,称Larmor进动,类似于陀螺在重力场中的进动,核的进动频率由下式决定:

ω= 2πυ0 =γ.B_0

若在与B0垂直的方向上加一个交变场B1(称射频场),其频率为υ1。当υ1 =υ0时,自旋核会吸收射频的能量,由低能态跃迁到高能态(核自旋发生倒转),这种现象称为核磁共振吸收。

υ= γB0/2π

同一种核,γ为一常数,B0场强度增大,其共振频率也增大。对于1H,当B0=1.4TG时, υ=60MHz;当B0=2.3TG时,υ =100MHz(1 TG = 104高斯,1MHz=106赫兹)

B0相同,不同的自旋核因γ值不同,其共振频亦不同。如 B0 = 2.3TG时,1H(100MHz),19F (94 MHz),31P(40.5MHz),13C(25MHz)。

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(三) 弛豫过程

当电磁波的能量(hv)等于样品某种能级差E时,分子可以吸收能量,由低能态跃迁到高能态。 高能态的粒子可以通过自发辐射放出能量,回到低能量,其几率与两能级能量差E成正比。一般的吸收光谱,E较大,自发辐射相当有效,能维持Boltzmann分布。但在核磁共振波谱中,E非常小,自发辐射的几率几乎为零。想要维持NMR信号的检测,必须要有某种过程,这个过程就是弛豫过程。即高能态的核以非辐射的形式放出能量回到低能态,重建Boltzmann分布的过程。 根据Boltzmann分布,低能态的核(N+)与高能态的核(N-)的关系可以用Boltzmann因子来表示:

N+/ N- = eE/KT ≈1 + ΔE/KT

ΔE 为两能级的能量差,K为Boltzmann常数,T为绝对温度。对于1H核,当T = 300K时,N+/ N-≈1.000009.对于其它核,γ值较小,比值会更小。因此在NMR中,若无有效的弛豫过程,饱和过程容易发生。 有两种弛豫过程即,自旋-晶格弛豫和自旋自旋弛豫。

自旋-晶格弛豫:

体系通过自旋-晶格弛豫过程而达到自旋核在B0场中自旋取向的Boltzmann分布所需的特征时间(半衰期)用T1表示,T1称为自旋—晶格弛豫时间。

自旋-自旋弛豫:

自旋-自旋弛豫反映核磁矩之间的作用。高能态的自旋核把能量转移给同类低能态的自旋核,结果是各自旋态的核数目不变,总能量不变。自旋-自旋弛豫时间(半衰期)用T2表示,液体样品T2约为1秒,固体或高分子样品T2较小,约10-3秒。 共振时,自旋核受射频场的相位相干作用,使宏观净磁化强度偏离z轴,从而在X-Y平面上非均匀分布。自旋-自旋弛豫过程是通过自旋交换,使偏离Z轴的净磁化强度MXY回到原来的平衡零值态(即在X-Y平面上均匀分布)。故自旋-自旋弛豫又称横向弛豫。

(四)核磁共振谱仪和实验技术

NMR波谱仪按磁体可以分为永久磁体、电磁体和超导磁体。按射频频率(1H核的共振频率)可分为60,80,90,100,200,300,400,...MHz等。按射频源又可分为连续波波谱仪(CW-NMR)和脉冲博里叶变换波谱仪(PFT-NMR)。

1 连续波波谱仪(Continual wave-NMR)

CW-NMR目前有60MHz、90 MHz等通用型谱仪;对化学工作者的例行测试带来极大的方便,其示意图见下图

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磁体:产生均匀而稳定的磁场(B0)。磁体两极的狭缝间放置样品管(内装溶解好的待测样品),样品管以每秒40-60周的速度旋转,使待测样品感受到的磁场强度平均化。

射频源:在与外磁场垂直的方向上,绕样品管外加有射频振荡线圈,固定发射与B0相匹配的射频(如60MHz、90MHz)。射频功率可供选择,既使待测核有效地产生核磁共振,又不会出现饱和现象,通常<或 = 0.05 mG(毫高斯)。

围绕样品管的线圈,除射频振荡线圈外,还有接收线圈,二者互相垂直,并与B。场垂直,互不干扰。在记录图谱时,由Helmholtz连续改变磁场强度,由低场至高场扫描,这种扫描方式称扫场(Field-Sweep),若改变射频频率的方式扫描称扫频(Frequency-Sweep)。当满足于某种核的共振频率时,产生NMR吸收。接收器、扫描器同时与记录系统相连。记录下NMR谱。

发射线圈和接收线圈紧密地缠绕在称做探头的小装置里,在两磁极间紧贴在样品管的周围。探头是NMR的心脏。

CW-NMR价廉、稳定、易操作,但灵敏度低,需要样品量大(10-50 mg)。只能测天然丰度高的核(如1H,19F,31P),对于13C这类天然丰度极低的核,无法测试。

2 脉冲Fourier变换波谱仪

PFT-NMR波谱仪在CW-NMR谱仪上增添两个附加单元,即脉冲程序器和数据采集及处理系统。PFT-NMR波谱仪使所有待测核同时激发(共振)、同时接收。均由计算机在很短的时间内完成。 脉冲程序控制器使用一个周期性的脉冲序列来间断射频发射器的输出。脉冲是一强而短的频带,是理想的射频源,调节所选择的射频脉冲序列,脉冲宽度可在1-50s围变化。脉冲发射时,待测核同时激发;脉冲终止时,及时准确地启动接收系统。待被激发的核通过弛豫过程返回到平衡位置时再进行下一个脉冲的发射。 接收器接收到的自由感应衰减信号(FID)是时域函数,记作F(t),通过Fourier变换运算,转换为频域函数F()。 PFT-NMR有很大的累加倍号的能力。对于13C NNM,收集一个FID信号通常约为1秒,若累加n次,则信噪比(S/N)可提高√n所得的总的FID信号进行Fourier变换仅需几秒钟即可完成,所以PFT-NMR灵敏度很高,可测天然丰度极低的核(如13C),能记下瞬间的信息对研究反应动态极为有利。还能测弛豫时间,这些都是CW-NMR所不能及的。

第二次世界大战的爆发中断了对核磁共振的研究工作,但战后的几年中对于该领域的研究却取得了突破性的进展。在美国,两组物理学家分别开始开发一种更简单的办法用于观察在液体和固体中分子的原子核的核磁共振现象,取代了Rabi的在真空状态下的观察核磁共振现象的实验。在哈佛大学有Edward Purcell领导的包括了Henry Torrey和Robert Pound的小组。在斯坦佛大学有由Felix Bloch领导的包括了Wiiliam Hansen和Martin Packard的团队。

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图解:1945年,两个独立的研究小组——一个由哈佛大学的Edward Purcell(上图)领导,另一个由斯坦佛大学的Felix Bloch领导——检测到在浓缩物质中的核磁共振现象。1952年,Bloch和Purcell因为他们具有划时代意义的实验而共享诺贝尔物理奖。(哈佛大学新闻办公室,剑桥,马萨诸塞州和斯坦佛大学新闻服务中心)

Purcell和Bloch都选择研究氢原子(H)的质子和原子核。 因为氢原子核是由单个的质子组成,因此其磁力矩非常显著。另一方面,氢元素由于其卓越的核特性,在地球无所不在以及在人体中作为水(H2O)的一部分而大量存在这三个特点而成为磁共振成像技术研究中的首选元素。Purcell的小组使用两磅固体石蜡作为氢元素的来源;Bloch的小组则使用装在一个玻璃球中的几滴水作为氢元素的来源。两个研究小组将样品放到一个磁场中,然后等待它们的原子核达到温度和磁力均衡的状态。处于这种磁化状态下时,与外界磁场相平行的原子核自身磁力线比相排斥的磁力线要稍微多一些。然后,像Rabi的研究小组曾经做过的那样,研究小组用无线电波来让样品中的原子核磁力矩发生偏转。Prucell和Bloch希望能通过观察旋转的原子核所吸收的能量或当共振条件被满足时被释放到无线电频率磁场中的能量来检测到核磁共振的发生。

1945年,在先后的两个星期里,两个小组都设法创造出了适合观察这一现象的外界条件。他们的实验演示了在技术上被称为在浓缩介质中的核磁共振(现在的缩写为NMR)。这实际上是对Rabi的实验发现——分子束核磁共振的延伸。1952年,Bloch和Purcell因为上述实验而共同获得诺贝尔物理奖。

对核磁共振的研究现在又获得了飞跃性的发展。Prucell和Bloch身边的研究人员迅速开始使用核磁共振波谱学来探索物质的化学组成和物理结构。在一系列工作中的第一个进展是被称为张弛周期的用于测量数值的成果——T1和T2。T1是实验样品中的原子核恢复初始状态磁力线所需要的时间;T2是样品发出的磁力信号的持续时间。Purcell的第一批研究生中的Nicolaas Bloembergen在该项研究中与Pound和Purcell一同扮演了重要的角色。Nicolaas Bloembergen于1946年从荷兰来到哈佛大学,他是第一个精确测量张弛时间的研究人员,同时在与Purcell和Pound的合作中,他还测量了这些原子如何在大量不同的液体和固体中发生变化。对于未来研究和技术应用来说非常幸运的是,张弛时间可以以秒或更短的时间单位进行计算,这使得核磁共振成为一种可行的研究工具。

1948年,Bloembergen、Purcell和Pound发表的一篇论文在物理学的多个学科都造成了深远的影响。控制张弛时间在化学和生物学领域为分析分子结构提供了一种极其有效的办法。而后来的研究人员还发现,这种办法对于人体结构内组织成像所需要产生的高对比度也是极其重要的。

(五)倾听回波

二十世纪四十年代末期,Rutgers大学的Henry Torrey和伊利诺依州立大学的Erwin Hahn分别在核磁共振成像领域跨出了新的一步。他们在实验样品上施加强无线电波脉冲而非传统的单一的持续波。他们首先观察到了在长脉冲条件下的瞬间核磁共振信号。在Hahn观察到瞬间核磁共振信号可以通过施加短脉冲测量之后,脉冲技术成为物理学家和化学家探索原子和分子的秘密的首要选择。 另外,Hahn发现一种后来被称为“旋转回波”的现象,这后来被证明对于测量张弛时间是非常重要的。第一次,他将这些看起来具有欺骗性的信号归因于他的电子设备的问题。在多次研究后,他认识到这些信号是由于在不同的本地磁场中的原子核旋转加速和减慢而造成的。通过施加两或三次短波脉冲并听到回波后,Hahn发现他可以在这样的条件下获得比单脉冲条件下更详细的关于原子核旋转张弛的具体信息。 20年后,脉冲核磁共振和旋转回波在核磁共振的发展中起到至关重要的作用。但是当时,使用核磁共振技术成像的想法还是没有让那些在物理和化学领域使用核磁共振波谱的科学家们产生更多灵感。因为在当时的情况下,在核磁共振可以成为一种有效的成像工具前,仍有一些必要的工作需要完成。一个重要的成果是一种被称为Fourier转换核磁共振的新式

脉冲方法,这种方法首先由Varian联合会的Rusesell Varian在50年代末期提出。几乎同时,在位于圣路易斯的华盛顿大学的Richard E. Norberg和Irving Lowe从实验的角度和理论的层面上展示了如何通过精确处理在脉冲实验中产生的信号从一个持续波实验中获得多组数据。但是,当时的精确步骤需要分析脉冲数据(一种被称为Fourier转换的技术),这由于当时的计算机条件限制而不可行。 二十世纪六十年代末期,当时为Varian联合会工作的Richard Ernst和Weston Anderson从化学的角度研究复杂的多线核磁共振波谱。通过反复实验和校对误差寻找产生所有多线光谱的频率是一个缓慢的过程。他们开始意识到向样品中的原子持续播发一段无线频率,然后对产生的脉冲信号进行Fourier分析可以获得持续波方法所有的结果。这种技术比传统的方法快了上千倍,而且可以让研究人员观察在仅有十分之一强度下的信号。那时计算机技术的发展让Fourier转换也成为可行。而现在使用核磁共振分析非常小的物体样品或区分一大堆样品中的非常少的原子也是可能的了。在1991年,Ernst由于他在高分辨率核磁共振波谱学领域的贡献而获得诺贝尔化学奖。

图解:不同的化学环境中(例如CH3、CH2和OH)的质子以不同的化学频率共振。CH3和CH2中质子的共振之所以不同是由于临近的碳原子中的质子共振与其自旋产生了交互性影响。(改编自“1H核磁共振波谱数据选集”,得克萨斯州A&M大学,热动力研究中心,1982年。现在,热动力研究中心是科罗拉多州国家标准技术协会的物理和化学产业分部的一部分。)

(六)成像科学

使核磁共振成像技术成为现实的一个决定性因素是处理大量而复杂的成像计算所必需的高速计算机。除了必要的计算能力外,还有其它三个领域的研究成果也为核磁共振成像技术的诞生奠定了基础。第一项技术是英国电子工程师Godfrey Hounsfield的研究成果。他在1971年制造了一种将X光机和电脑结合起来的仪器,并利用某些代数复制的原理从多个角度对人体进行扫描,从而创造出一种内部结构的剖面图效果。实际上,Hounsfield并不知道,南非的核物理学家Allan Cormack原本在1957年就公开发表了同样的设想,他使用的是一种被称为Radon转换的复制技术。虽然Cormack的研究成果并未得到广泛的传播,但1979年他仍然由于在计算机化X射线断面成像(CT)技术领域的杰出贡献而同Hounsfield共享了诺贝尔医学奖。CT技术的基本原理是很多在今天使用的成熟成像方法的基础。 对核磁共振成像至关重要的另两项研究成果同核磁共振相关。其中一项是将核磁共振技术作为医学检测工具的概念化;另一个是从核磁共振数据中获得有效图像的可行方法的发明。 早在1959年,位于Berkeley的加州大学的J.R.Singer就曾建议,核磁共振技术可以被用作医学方面的检测工具。几年后,Baylor医学院的Carlton Hazlewood公布了使用核磁共振技术检查病人的肌肉疾病的研究成果。然后在1969年,在纽约布鲁克林区Downstate医学中心工作的物理学家Raymond Damadian开始设法使用核磁共振技术来探查人体内部的癌症早期的征兆。在1970年的一次实验中,他利用外科手术切除了在实验室老鼠身上移植的快速生长的肿瘤,并证明肿瘤的核磁共振信号同其它正常组织的信号是不同的。Damadian在1971年的《科学日报》上公布了这项实验的结果。但是至今,Damadian的方法不能证明在临床检测癌症方面是可靠的。 而让根据人体活性组织产生的核磁共振信号制成有效的图像成为可能的关键技术进步要归功于在70年代初期领导位于匹兹堡的核磁共振专营公司的化学家Paul Lauterbur。1971年,他看到化学家Leon Saryan重复Damadian对老鼠身上的肿瘤和健康组织进行的实验。Lauterbur得出结论,认为这项技术不能为检查肿瘤提供足够的信息,因此他继续对该技术进行改进,以获得一种使用核磁共振技术制图的有效方法。技术的关键在于能够对样品中发出的核磁共振信号进行精确的定位:如果每个信号的位置都能被测定,样品的整体图像就可以制作出来。 Lauterbur的破天荒的创意是在空间上统一的静力磁场上添加一个较弱的磁场,这个磁场用一种控制方法使其在位置上不与第一个磁场重叠,这样便创造出一种磁场强度上的差异。在样品的一端,叠加的磁场强度会很强,而在另一端由于精确的校准,磁场强度会趋向于变弱。因为在外部磁场中的原子核的振荡频率同磁场强度成正比,不同位置的样品会以不同的频率振荡。这样,可以根据不同的位置得出一个不同的共振频率。而且,各频段共振信号的强度可以根据样品中包含的以不同频率共振和处于不同位置的原子核显示出相应样品中的具体信息。在信号上的细微差别可以用来为分子的位置进行定位,从而制出相应的图像。(今天的核磁共振成像设备在被检测物体上叠加三套电磁偏差线圈来为三种空间上的相关信号进行编码。) 在大西洋另一端的英国,英格兰诺丁汉大学的Peter Mansfield也有着类似的想法。1972年,他的研究逐渐深入到使用核磁共振获得水晶物质在结构上的细节的领域。在1973年公布的研究结果中,Mansfield和他的伙伴也使用了磁场偏差的方案。在1976年,Mansfield开发出一种快速扫描核磁共振成象技术,即回波平面成像技术。这种技术在几微秒内便可扫描整个大脑。回波平面核磁共振成像技术对于在中风诊断中使用的快速核磁共振成像技术和用于脑部研究的功能性核磁共振成像技术都是至关重要的。 在1972年发表时,Lauterbur的研究成果包括了一张测试样品——一对浸在水瓶中的试管——的图像。在使用小型核磁共振扫描仪(他同时还使用了从CT扫描中借鉴的被称为后部发射的技术)得到了上述成果后,他继续对小的物体——包括她女儿从他家附近的长岛抓到的一只小螃蟹进行成像的努力。到1974年,他已经可以使用大型核磁共振成像设备对活老鼠的胸腔进行成像了。Mansfield在1975年时也可以对一些植物的茎以及一只死火鸡的腿进行成像。第二年,他拍摄下了第一个人类的核磁共振成像照片——一个人的手指部的成像,包括检测到的骨头、骨髓、神经以及血管。Damadian与此同时也致力于成像技术的研究。1977年,他成功地对一个男性的胸腔进行了成像。 到二十世纪八十年代初期,核磁共振成像技术领域的迅速发展让这种技术进入商业领域成为可能。(由于容易让人产生不愉快的联想,“核”这个词被悄悄地从核磁共振技术的术语中去掉了。)高速计算机及超导磁铁的出现让研究人员能制造出在敏感性和分辨率方面有了极大提高的更大的核磁共振设备。

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图解:一名技术人员正在利用核磁共振成像设备扫描一个病人的头部。今天,高速计算机的开发和超导磁铁的应用使核磁共振成像设备提供具体的解剖结构图像成为可能。功能性核磁共振成像技术也可以让脑部及其它器官功能的变化图形化。这些功能使核磁共振成像设备成为一种在现代医学中前途无量的检测仪器。(美国放射医学学院)

(七)从结构到功能

作为一种对活性组织的解剖和结构进行成像的强大工具,核磁共振成像技术在二十世纪八十年代至九十年代这一段时间内由于其对有机体的成像方面的发展而得到了极大的加强,并用于研究功能。这项突破直接导致了功能性核磁共振成像技术的出现。众所周知,功能性核磁共振成像技术出现于二十世纪八十年代初期。当时,英国牛津大学的George Radda和他的同事发现核磁共振成像可以用来表现血液中氧含量的变化,这个特性可以用来探索人体的生理活动。而血液氧气水平反转成像的基本原理已经在约40年前由Linus Pauling描述过。1936年,当时在加利佛尼亚理工学院的Pauling和Charles D. Coryell就发表了一篇论文,描述了携带氧气,同时也让血红细胞带上红色的血色素带有磁性的理论。 在更早的1845年,发现了电磁感应的英国物理和化学家Michael Faraday就曾研究过干血的磁特性,并在笔记中记录下:“必须用最新的流动血液来进行研究。”虽然他做过类似的研究,但却没有继续下去,从而将这个课题留给了90多年后的Pauling和Coryell。后来,这两名化学家发现完全携氧的动脉血的磁化系数同完全卸氧的静脉血相比竟相差20%。 1990年,AT&T贝尔实验室的Seiji Ogawa在报告中称,他在对动物进行研究时发现去氧血色素被放到磁场中时,会提高附近的磁场强度,而携氧血色素则不会。Ogawa在研究报告中展示了带有很多去氧血色素的区域会将血液器皿周围的磁场略微扭曲,并在一个核磁共振的图像中揭示了这些扭曲的图像。 其它的研究人员也开始研究人类身体中的类似现象。例如1992年,一些研究人员,包括Ogawa,马萨诸塞州中心医院的John W. Belliveau和威斯康星医学院的Peter Bandettini公布了对人体大脑对使用功能性核磁共振成像技术产生的感官刺激的反应的研究结果。在其它应用领域,功能性核磁共振成像技术目前可以帮助指导非脑部敏感区外科手术,检查中风症状以及解释大脑的工作原理。 到今天,由Rabi开始的研究已经发展成为价值数十亿美元的产业。核磁共振成像扫描和波谱学已经广泛应用于医学检测成像领域。同时,作为在过去几年中最新的一项技术以及最强大的设备,功能性核磁共振成像技术的速度和精确度也获得了极大的提高。 上述这些成果如果没有Rabi第一次检测到核磁共振现象及之后近40年的基础研究是不可能成功的。这段时间内的发现同包括对研究原子和分子的磁特性感兴趣、试图发现他们如何互相作用并用核磁共振理论解释原子和分子的基本结构的物理学家和化学家们的努力密不可分。正如Prucell的第二个研究生Geroge Pake所说的那样:“没有这些基础研究,核磁共振成像技术根本无从想象。”

 
exp/核磁共振实验.txt · 最后更改: 2009/12/02 09:33 由 whyx
 
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